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                RNA的保護

                更新時間:2010-01-26  |  點擊率:3798

                RNA的保護
                與DNA提取實驗相比,RNA的提取實驗常常較為困難,這主要是由
                于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因來自內因和外因兩個方
                面。內因:RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基,易被水解;外
                因:生物體內和外部環境中存在大量RNase,并且RNase不易失活,
                高溫后仍然能夠正確折疊恢復活性。因此,從樣品的儲存、RNA的提取
                以及RNA提取完成后的保存,我們都需要格外小心,處處防范RNase對
                RNA的降解作用。下面,我們將介紹RNA提取過程中保護RNA的措施。
                1、提取前的RNA保護
                材料樣品中的RNA保護:一般而言,在收集材料樣品準備提取RNA
                時,我們首先應該選擇新鮮的材料,取樣后迅速液氮研磨或勻漿處
                理,以保證我們所要提取材料中的RNA本身是完整的。如果收集好
                材料后,不能馬上進行RNA的提取工作,就需要先將材料保存好,
                冰凍材料保證低溫儲存,防止反復凍融,以保證材料中的RNA在保
                存過程中不被降解。液氮低溫保存法是一種常用的保存方法。先將
                材料在液氮中速凍后保存于-70℃冰箱或直接保存在液氮中。
                實驗室中RNA提取工作區RNase的清除:自然界中的RNase含量非常
                豐富,在空氣中會有許多RNase存在。因此,在RNA提取實驗中應該
                辟出RNA提取專區,該區域要進行RNase的清除處理,同時要注意避
                免同其它實驗區發生交叉污染。
                實驗耗材、玻璃器皿上的Rnase的清除:所有提取RNA要用到的耗材
                和器皿都要進行RNase清除處理。使用無RNase的塑料制品、槍頭、
                移液器、電泳槽等避免交叉污染,實驗臺面等要*處理。RNA處
                在Trizol試劑中是不會被RNase降解的,但提取后的繼續處理過程中應
                使用不含RNase的塑料或玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時以
                上,塑料器皿可用DEPC處理后再高壓滅菌,即可去除RNase。實驗所
                用的試劑或溶液,必須確保無RNase。配制溶液應使用無RNase的水。
                2、提取過程中的RNA保護
                組織破碎過程中的RNA保護:選擇合適的勻漿方法,盡可能減少勻
                漿的時間,保持低溫勻漿。在進行細胞裂解之前,一般要先將組織
                塊破碎。破碎所采用的方法主要有液氮研磨或勻漿處理。液氮研磨
                時注意不要讓液氮揮發干凈,因為液氮可以充分抑制RNase,一旦
                液氮揮發干凈,就可能造成內源RNase對RNA的降解作用。
                細胞裂解過程中的RNA保護:選擇合適的裂解液,裂解液的量要足
                夠,裂解要充分。在裂解液加量一定的情況下,所加入的提取材料
                的量就應該按說明書中的比例加入,如果材料太多,會造成裂解不
                充分和RNase抑制不充分的雙重后果,從而使RNA的得率、完整性
                和純度都受到破壞。
                實驗人員的注意事項:在提取RNA的過程中,實驗操作者本身也應
                該注意相關問題。因為我們的手上、唾液中都會有大量的RNase存
                在,所以在進行RNA提取實驗時,應該戴上口罩,并及時更換手套。
                這不僅是對RNA的保護措施,同的也是對實驗操作者自身的保護。
                3、保存過程中的RNA保護
                在經過從材料采集到RNA提取等一系列精心地準備和實驗之后,我
                們終于得到了高質量的RNA,那么接下來的RNA保存就成為重點
                問題,而其中關鍵的問題就是如何避免保存過程中的RNA降解。
                RNAsafe就是在RNA保存過程中常用的一種RNase抑制劑,它能夠高
                效去除溶液中可能存在的RNase污染,保證RNA完整性不受破壞。
                4、后續實驗中的RNA保護
                RNA的提取歸根到底只是一個基礎實驗,這就意味著我們還要用
                RNA來完成許多后續實驗,例如:RT-PCR,Northern blot,體外
                轉錄和翻譯等。那么在這些后續實驗中,也需要對RNA進行持續的保
                護,RNasin就是在這類后續實驗中的應用廣泛的RNase抑制劑。




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